感染性疾病mNGS检测结果解读的应用
由于技术的快速发展和成本的大幅降低，宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）的应用正在从研究转向临床实验室。尽管许多研究和病例报告已经证实mNGS在改进传染病的预防、诊断、治疗和追踪方面取得了成功，但仍有一些障碍必须克服。mNGS的结果会展示样本中的全部可能病原体，然而面对着数千种会感染人类的微生物，如何准确判读其中关键致病病原体是具有挑战性的。迄今为止，在临床实践中，mNGS的解读标准也尚未统一。本文就mNGS在不同系统中病原体感染的结果解读，mNGS结果的临床解读和应用规则，以及mNGS解读在病原体诊断中面临的挑战进行阐述。
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感染性疾病是临床常见疾病，而病原体诊断是其诊治中的关键环节。传统的病原体检测方法耗时长、阳性率低，难以满足临床需求。宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）作为一种新型病原检测方法，既不依赖于传统的微生物培养，也不需要特异性扩增，且其检测范围广泛，可检测细菌、病毒、真菌、寄生虫、罕见病原体，甚至未知病原体［1］。mNGS具有随机、无偏倚特征，可以准确获得检测样本中所有核酸信息，与已知的微生物序列数据库进行比对分析（比对：指将测序的序列与参考基因组进行匹配的过程），根据序列信息鉴定样本中所含的所有病原微生物，分析出致病病原体，指导临床诊断和治疗，预防病情进一步恶化，尤其在疑难、罕见感染性疾病中发挥着重要作用［2］。目前，mNGS已被报道用于呼吸系统、中枢神经系统、血流感染、骨和关节、眼部感染等多系统感染性疾病的诊断和病原鉴定［3, 4］。
然而，对于mNGS结果的解读尚缺乏“阳性或阴性”的定义等标准，对结果也没有统一明确的解读规范，包括序列数阈值、敏感性及特异性评估的统一临床标准［5］，因此与所有其他新技术一样，在解释和报告数据方面仍然存在重大困难和挑战［6］，也容易导致不同操作人员的检测结果不同，因此造成mNGS存在一定的假阳性和假阴性，可能会影响mNGS的临床应用。mNGS的另一大主要局限性是无法区分被检测病原体的致病性状态，以及难以区分致病性微生物和定植微生物。例如，在一项研究中，利用mNGS在100份肺泡灌洗液样本中鉴定了225种细菌、真菌和26种病毒，其中大部分属于呼吸道共生微生物组或污染，无临床相关性［7］。并且如此大量的信息会使医生在做临床决策时感到困惑，甚至产生误导。到目前为止，大多数关于mNGS的研究都集中在其对特定病原体感染的诊断价值上［8, 9］，关于准确解释所有检测结果的文献及解释规范很少。本文主要阐述mNGS应用于不同系统中病原体感染的结果解读，mNGS结果的临床解读和应用规则，以及mNGS解读在病原体诊断中面临的挑战，以期更好地指导mNGS在临床诊断中的应用。
一、不同系统中病原体感染的结果解读
1.呼吸系统感染：
呼吸道感染往往由多种病原体引起，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫，因此，准确、及时地诊断感染原因对于呼吸道感染的适当治疗和改善预后至关重要，特别是对于合并感染需要联合治疗的患者［10］。呼吸道样本是开放性样本，通常会含有呼吸道定植菌群。肺泡灌洗液原则上应是无菌样本，但是由于取样的不规范，也会存在污染定植菌的问题。所以对于呼吸道样本要根据病原体的致病性分级考虑［11］。结果解读时先不考虑常见定植微生物，例如韦荣球菌属、普雷沃菌属、罗氏菌属、奈瑟菌属、放线菌属、卟啉单胞菌属等；但是对于条件致病菌，需根据其检出相对丰度和临床指征，判断是否为致病病原体（相对丰度：指除去宿主序列之后，某微生物物种序列在相应大类物种中的分布比例）；如果存在大量的背景菌或杂菌序列，而无主导微生物，首先应考虑污染，其次考虑条件致病菌。有研究认为条件致病细菌和真菌在种水平上的相对丰度大于30%可考虑为潜在病原体［12］。对于严格致病菌，例如结核分枝杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、诺卡菌、军团菌等胞内菌，则检出一条特异性序列即可考虑是致病病原体［13, 14, 15］。Miao等［15］认为结核分枝杆菌的DNA提取困难且污染可能性低，在20 M数据量下，当至少有一条特异性序列在种或属水平与参考基因组对齐时，可认为是阳性；对于真菌（主要包括曲霉属、毛霉属、隐球菌属和双相真菌等）的鉴定，其特异性序列数是任何其余真菌的5倍以上，判为阳性；而当病毒的特异性序列数≥3时，则可认为是阳性。
2.中枢神经系统感染：
传统的微生物检测通常不足以检测出所有的神经侵袭性病原体，而脑脊液或脑组织的mNGS检测可筛查几乎所有潜在的中枢神经系统感染，并识别出罕见的或新的病原体［16］。由于脑脊液被认为是一个正常无菌的部位，对脑脊液mNGS数据的解读将比来自非无菌部位（如呼吸道和粪便）的数据更直接。在一项为期1年的多中心前瞻性研究中，美国Charles Chiu实验室对1年内美国8家医院的204例原发性脑炎、脑膜炎或脊髓炎患者的脑脊液样本进行了mNGS检测，并首先为国外脑脊液病原体鉴定建立了mNGS检测的阈值标准［17］。同样地，有作者［18］在国内也开展了一项前瞻性、多中心系列案例研究，对1年内中国20家医院的276例脑炎或脑膜炎患者的脑脊液样本进行了mNGS检测，并主张基于标准化为20 M的测序数据量中种特异性序列数（species specific read numer，SSRN）进行判断：（1）对于胞外细菌、真菌（隐球菌除外）和寄生虫，若检测到的SSRN≥30，在阴性对照中未出现且在细菌、真菌、寄生虫中排名前10位，或者在阴性对照中出现，检出序列数是阴性对照的10倍且在过去1个月内未高频出现（高频判断标准：同一标本类型频次>25%），则样本结果为阳性；（2）对于胞内细菌（结核分枝杆菌和布鲁菌除外）和隐球菌，若检测到的SSRN≥10，在阴性对照中未出现且在细菌、真菌中排名前10位，或者在阴性对照中出现，检出序列数是阴性对照的10倍且在过去1个月内未高频出现，则样本结果为阳性；（3）对于病毒、结核分枝杆菌和布鲁菌，若检测到的SSRN≥3，则认为结果为阳性。从上述阳性判断标准可以看出如果某些病原体的丰度极低，尽管能被检测到，但可能低于给定mNGS检测的临床报告阈值［2］，从而被判读为阴性。
3.血流感染：
血流感染（blood stream infection，BSI）是一种由病原微生物入侵引起的严重的全身感染性疾病，可对人体组织器官造成不同程度的损害［19］。BSI测序包括两种方法，即血浆循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）和全血测序［20］。全血测序这种方法可以直接识别血液中存在的病原体，并克服了cfDNA检测的一些局限性，如对肠道、口腔等细菌的非特异性检测，以及不能检测抗生素耐药性（antimicrobial resistance，AMR）［21］。健康个体的血液中也存在少量微生物游离 DNA，综合几项血流感染mNGS的研究，可总结出mNGS阳性结果的标准如下：（1）细菌（不包括分枝杆菌）和病毒：其覆盖度比其他细菌、病毒高10倍［22］（覆盖度：指达到给定深度的测序碱基占整个基因组或目标区域的百分比）；（2）真菌：由于其提取DNA的生物量较低，其覆盖度比其他真菌高5倍［23］。在覆盖度排名前10或前5的病原体中，如果特异性序列数>3，则应将致病微生物视为阳性［24］。
4.骨和关节感染：
骨和关节感染（bone and joint infections，BJIs）是复杂的感染，需要精确的微生物记录来优化抗生素治疗，病原微生物的鉴定是准确诊断和成功治疗BJIs的关键［25］。为了识别BJIs的病原体，根据Cai等［26］研究，将细菌鉴定的最佳阈值为属水平相对丰度≥15%，真菌鉴定的最佳阈值为属水平相对丰度≥30%。在Huang等［4］对骨关节感染的研究中提到伯克霍德菌属（Burkholderia）、罗尔斯顿菌属（Ralstonia）、噬酸菌属（Acidovorax）和代尔夫特菌属（Delftia）在各属水平上的相对丰度≥85%时才为阳性，之所以如此判读是因为它们被认为是实验室中最常见的污染属，且很少被鉴定为BJIs的病原体。
5.眼部感染：
有研究已表明，mNGS能够成为眼部感染和眼表疾病的可靠诊断工具［27］，但由于可能涉及的病原体众多，导致感染性眼病的病原学诊断成为难点。在一项眼部感染（葡萄膜炎）的研究中［28］，鉴于样本量少，学者采用了一种保守而简单的方法来避免对测序结果的过度解释。首先，利用阴性对照（水）来识别背景菌和实验室污染菌；然后从患者样本中检测到的生物列表中进行背景、污染菌去除。如果满足以下条件，剩余的生物体则被认为是潜在的病原体：（1）该微生物在物种水平上具有≥20个非冗余的，基于核苷酸比对的特异性序列数；（2）对于被认为是潜在病原体的生物体，它必须具有已知的致病潜力。
6.尿路感染：
尿路感染（urinary tract infections，UTIs）是一个严重的公共卫生问题，80%以上的尿路感染是由大肠杆菌引起的，其他较常见的是肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌和腐生葡萄球菌等［29］。但由于近年来抗生素滥用严重，其他细菌引起的病例也在增加，随之而来的是病原体对抗生素的耐药性急剧增加［30］。然而，目前尚无研究建立尿路感染病原体阈值的标准，这使得结果仍然难以解释。
7.复杂和罕见病原体感染：
病原体的类型影响测序数据的数量。考虑到微生物基因组大小的差异，先将检测到的序列按照每百万序列数（reads per million，RPM）进行标准化。对于强致病及非典型病原体，如结核分枝杆菌、嗜肺军团菌、脓肿诺卡菌、皮疽诺卡菌、单核细胞增生李斯特菌、肠沙门菌、马耳他布鲁菌、流产布鲁菌、猪布鲁菌、新型隐球菌、格特隐球菌、黄曲霉、米曲霉、马尔尼菲篮状菌、贝纳柯克斯体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、沙眼衣原体、斑疹伤寒立克次体、恙虫病东方体、惠普尔养障体等，根据同批次检出情况排除了批次污染后，检出1 RPM即可考虑其为致病菌［31］。Zhang等［32］认为耶氏肺孢子菌RPM在真菌中排名前15位或其在真菌中相对丰度高于85%可能是该病原体临床诊断的满意阈值（cut-off value）；而对于寄生虫，应用的阈值应在10 RPM以上，并应严格确认序列的特异性。
根据已有研究，mNGS用于鉴定结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）和非结核分枝杆菌（non-tuberculous Mycobacterium，NTM）的阳性率较低［33］。MTB作为胞内致病菌，细胞外游离DNA少，核酸序列提取困难。结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）包括结核分枝杆菌、卡内蒂分枝杆菌、非洲分枝杆菌和牛分枝杆菌等，由于MTBC成员表现出>99.99%的基因组序列相似性［34］，因此很少有物种特异性序列。对于MTB感染，有学者建议应关注匹配MTBC中的特异性序列，而不是某单一物种的特异性序列，为避免误解，他们还建议报告MTBC的结果，而不是具体种类的MTBC［14］。另有研究显示，mNGS在排除标本污染的前提后，若检测出至少1条种或属水平且比对为真的结核分枝杆菌序列就具有临床意义，可判为阳性［35, 36］。非结核分枝杆菌也可能是环境中污染菌，若检出，需结合背景微生物库和mNGS原始细菌列表进行结果判读，若排除污染后其属水平或种水平序列数在细菌中排名前十，则有临床意义［37］。
二、mNGS结果的临床应用
1.临床评估和实际考虑因素（实验室因素与临床因素）：与其他诊断分析一样，mNGS检测也很容易受到污染。mNGS结果中的“污染”来源包括在实验室试剂或环境中检测到的正常人体菌群或背景污染生物体，以及生物信息学分析或数据库错误［38］。鉴于mNGS的非靶向性，病原体诊断的一个关键限制是背景干扰，通常来自人类宿主 DNA。因此，在高背景样本中，mNGS阴性结果可能对排除感染的作用较小，应考虑其他对背景敏感性较低的诊断检测，如结核分枝杆菌qPCR验证、16S rRNA细菌PCR［39］和ITS 真菌PCR［40］，这在脑脊液中白细胞计数高的细菌性脑膜炎病例中尤其重要。一项准确性研究表明，约7%的临床样本检测到超过预设阈值的多个细菌属，通常由环境或皮肤菌群组成［18］。在临床微生物学中，确定可能是污染物的微生物的临床意义是一个经典问题，通常需要临床背景来解释。因此，作为一种临床诊断手段，mNGS最终识别的潜在病原体必须置于临床环境中，以确定它们是否与临床相关。临床医生在解读mNGS结果时，需考虑患者的免疫状态和临床表现是否一致，同时结合其他检测手段如传统培养、影像学、血清学检测等结果进行综合判断，去伪存真。
2.mNGS报告的临床应用规则：mNGS检测结果通常以官方报告的形式提供给临床医生，列出检测到高于报告阈值的细菌、真菌、DNA/RNA病毒或寄生虫，被认为是环境污染物的生物体不被报告，医生最终需要根据患者的临床症状来确定真正的病原体［2］。mNGS报告中所呈现的信息是经过特定阈值过滤后的结果，它并不能作为临床决策的唯一依据［13］。对于阴性报告，临床医生可能需要首先分析患者的具体情况，考虑患者免疫状态及临床表现的符合性，再研究报告以外的原始检测结果，以确定是由于对阈值的错误判断还是由于没有病原体存在。当罕见病原体在报告中出现时，需要进一步确定其致病性及临床特征，包括感染病灶的影像学检查；并且罕见病原体的确认有必要进一步调查患者的病史，以确定其为动物疫源或者环境疫源的流行病学证据。
三、mNGS解读在病原体诊断中的挑战
1.结果解读的准确性：
在实施mNGS检测以诊断病原体感染时，必须考虑多种因素，以最大限度地提高准确性和临床相关性。基于mNGS无偏性和高度敏感的特点，检测报告中可能会出现假阳性结果。mNGS的假阳性主要可以分为两种类型：第一种类型来自mNGS检测流程，包括mNGS文库制备过程中样本中的污染物病原体DNA、匹配样本低质量读取的低复杂性序列、注释错误的物种，或来自数据库条目的污染物，这些条目也包含对人类DNA、测序适配器或载体定植的读取［34，41］。由于测序读取长度短、数据库不完整、算法不正确或基因组高度同源而导致的错误分类也会产生假阳性结果［41］。例如，因两个基因组之间的相似性，大肠埃希菌经常被错配为痢疾志贺菌［42］；如果金黄色葡萄球菌的覆盖率太低而无法准确区分，偶尔也会被鉴定为表皮葡萄球菌［4］；还有炭疽芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌同源性高，难以区分，这两种菌对临床影响极高，因此对正确解读要求也极高［43］。第二种类型的假阳性来自mNGS流程之前的过程，主要来自整个样本采集、处理过程及检测试剂生产过程引入的污染，只能通过临床诊断排除［34］。为了降低mNGS操作前的污染风险，建议在样品采集过程中制定严格的无菌程序。开发和使用不含或极低水平DNA污染的超净试剂也有助于最大限度地减少检测污染［17］。此外，由于mNGS结果容易受多种因素影响，各个研究标准在应用于其他实验室或检验中心之前应彻底修订和检测，并仔细监测和评估假阳性的风险。临床医生在选择mNGS时还应考虑传统培养的结果，并根据临床实际做出准确判断。
另一方面，mNGS也存在假阴性结果，其影响因素可分为临床因素和实验室因素。临床因素包括样本采集时间、样本类型、取样和方法选择。实验室因素包括实验室试剂、实验室操作、测序、数据分析和报告撰写。一些具有硬细胞壁的病原体，如真菌，可能会降低核酸提取的效率［44］，当病原体载量低于mNGS的检测限（limit of detection，LOD）时，可能会出现漏检。研究也发现在多微生物联合感染中，少数病原体的相对丰度可能远低于优势病原体，并通过相应的阈值被准确过滤掉，造成假阴性结果而导致漏报［4］。
2.结果解读的复杂性：
mNGS结果解释复杂化的一大方面是背景信号，由瞬时定植微生物或潜在微生物群［45］、试剂、实验室或空气环境污染［46］、宿主免疫反应［47］等因素造成。mNGS在建立最佳阈值以区分真实病原体和背景微生物方面仍然是一个挑战［4］，尤其对于由低丰度病原体引起的低级别感染，压倒性的背景噪音是一大混淆因素。mNGS结果与测序平台、生物信息学分析和实验室环境高度相关，也会导致解释mNGS结果的复杂性［48］。
mNGS结果解读的第二个重要考虑因素是，患者在获得样本之前是否接触过抗生素。虽然在抗生素降低培养产量后，病原体特异性PCR和mNGS可以检测到残留的微生物核酸，但在这种情况下，mNGS阴性结果需要谨慎解释。Wilson等［19］的一项前瞻性研究表明，如果患者的感染是分区域的（如脑脓肿），或者当疑似病原体通常由于脑脊液丰度过低或缺乏而经血清学诊断（例如引起莱姆病的伯氏疏螺旋体或引起梅毒的梅毒螺旋体），则应特别谨慎解释脑脊液 mNGS阴性结果。
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四、结语与展望
mNGS在未来可作为克服传统诊断方法缺点的新工具。它是对样本中存在的所有生物体的核酸进行测序和表征的过程，理论上具有检测患者样本中任何感染性生物体的能力［7］。该技术能够快速和准确地鉴定病原体可以实现量身定制的治疗，减少广谱抗生素的过度使用，并促进患者的最终康复。在复杂的临床样本中识别所有微生物、评估每种微生物的毒力和抗生素敏感性特征，并同时表征宿主对感染的反应的潜在能力，这为mNGS在将来取代现有技术并成为未来传染病诊断的主要方法提供了机会［49］。
综上所述，对于各个系统感染性疾病的病原学诊断，mNGS技术是未来发展的方向。mNGS还可用于传染性疾病的早期发现、溯源与准确诊断，以实现疾病预防控制和精准诊疗［50］。目前，mNGS在感染性疾病的识别和诊断中发挥着相当重要的作用，尤其对于疑难、危重、特殊病例感染。mNGS仍有许多方面需要进一步完善与改进，如对不同感染病原体的序列诊断阈值标准的确定、背景菌与致病菌的鉴别及耐药菌基因的检测等。此外，对于mNGS结果解读，尚缺乏指引性行业标准的建设性意见，需要测序分析专业技术人员、检验医生、临床医生等多方对结果的共同解读。
引用:蒋析文, 梁志坤, 曾莉, 等. 感染性疾病mNGS检测结果解读的应用[J]. 中华预防医学杂志, 2023, 57(7): 1124-1130.